Аннотация
НА (hyaluronic acid – гиалуроновая кислота) присутствует в организме практически всех позвоночных и играет важную роль в развитии тканей и пролиферации клеток. Было продемонстрировано, что она способствует заживлению ран и участвует в механизмах ангиогенеза и воспаления. Также было дока-
зано, что PN (полинуклеотид) способствуют росту и повышают активность фибробластов и остеобластов человека in vitro, улучшают репарацию фибробластов, поврежденных средневолновым ультрафиолетовым излучением, и, по всей видимости, способствуют пролиферации преадипоцитов человека. Несколько ис-
следований in vivo также продемонстрировали воздействие PN in vivo, связанное с повышением ангиогенеза и стимулированием процесса заживления. В настоящей статье воздействие смеси полинуклеотидов и гиалуроновой кислоты на культивируемые фибробласты человека оценивалось посредством анализа роста клеток. Также испытаниям была подвергнута другая смесь, и было продемонстрировано, что присутствие НА даже в низкой концентрации (1 мг/мл) было связано с повышением активности PN, составлявшим до 20% включительно. Кроме того, добавление HA в дозе 1мг/мл к PN в дозе 100 мкг/мл обуславливает скорость роста клеток, сопоставимую со скоростью, наблюдавшейся при концентрации PN, равной 1000 мкг/мл.
Ключевые слова: полинуклеотиды; фибробласты, гиалуронат; кожная регенерация
НА (hyaluronic acid – гиалуроновая кислота) присутствует в организме практически всех позвоночных и играет важную роль в развитии тканей и пролиферации клеток. Было продемонстрировано, что она способствует заживлению ран и участвует в механизмах ангиогенеза и воспаления. Также было дока-
зано, что PN (полинуклеотид) способствуют росту и повышают активность фибробластов и остеобластов человека in vitro, улучшают репарацию фибробластов, поврежденных средневолновым ультрафиолетовым излучением, и, по всей видимости, способствуют пролиферации преадипоцитов человека. Несколько ис-
следований in vivo также продемонстрировали воздействие PN in vivo, связанное с повышением ангиогенеза и стимулированием процесса заживления. В настоящей статье воздействие смеси полинуклеотидов и гиалуроновой кислоты на культивируемые фибробласты человека оценивалось посредством анализа роста клеток. Также испытаниям была подвергнута другая смесь, и было продемонстрировано, что присутствие НА даже в низкой концентрации (1 мг/мл) было связано с повышением активности PN, составлявшим до 20% включительно. Кроме того, добавление HA в дозе 1мг/мл к PN в дозе 100 мкг/мл обуславливает скорость роста клеток, сопоставимую со скоростью, наблюдавшейся при концентрации PN, равной 1000 мкг/мл.
Ключевые слова: полинуклеотиды; фибробласты, гиалуронат; кожная регенерация
1. Введение
Критическая роль микросреды в жизненном цикле клетки подтверждается большим объемом данных. Известно, что область, окружающая клетки, играет важную роль в нормальных тканях, регулируя концентрацию фактора роста, снабжая ткани питательными веществами и поддерживая интенсивное вза-
имодействие клеток. В период развития ткани эта высокоорганизованная микросреда изменяет свои функции, определенным образом модифицирует их. Микросреда представляет собой сложную структуру, образованную комплексом молекул, включая белки (коллагены, фибронектин, эластин), фрагменты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и сложные полисахариды в форме протеогликанов и гиалуронана.
Источником фрагментов ДНК считается полидезоксирибонуклеотид. PN представляет собой соединение, которое путем активации аденозиновых рецепторов оказывает различные виды воздействия на мезенхимальные клетки. Thellung e coll и Sini e coll [1, 2], впервые продемонстрировали, что PN усиливают пролиферацию фибробластов человека и вовлечение пуринергических рецепторов A2. Некоторые другие авторы изучали воздействие PN как in vitro, так и in vivo: было продемонстрировано, что PN стимулируют рост фибробластов роговицы человека [3] и остеобластов [4], улучшают репарацию фибробластов, поврежденных ультрафиолетовым излучением [5], и, по всей видимости, способствуют пролиферации преадипоцитов человека [6].
Многочисленные исследования in vivo продемонстрировали эффект PDRN (полидезоксирибонуклеотид) у пациентов, перенесших эксплантатацию кожи [7], а также его воздействие на эпителизацию роговицы после фоторефрактивной кератотомии [8].
Также было испытано влияние PN на восстановление костей [9,10], и продемонстрировано улучшение процесса заживления. Наконец, было показано, что полинуклеотид стимулирует заживле ние ран и ангиогенез, индуцируя повышение секреции VEGF (vascular endothelial growth factor – фактор роста эндотелия сосудов) при патологических состояниях с низкой тканевой перфузией, таких как сахарный диабет и тепловое повреждение [11-13].
PN представляет собой действующее вещество препарата, который используется в терапии в качестве средства, стимулирующего восстановление тканей. PN получают из молоки форели, выращенной для потребления человеком.
Фармацевтическую субстанцию получают путем экстракции с очисткой и высокотемпературной стерилизацией, позволяющей получить фармацевтическую субстанцию 95%-ной чистоты, не содержащую фармакологически активных белков и пептидов. Это соединение содержит смесь полимеров дезоксирибонуклеотидов с длиной цепи от 50 до 2000 п.о. и может также являться источником пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеозидов/дезоксирибонуклеотидов и оснований. HA присутствует в организме практически всех позвоночных и играет важную роль в развитии тканей и пролиферации клеток [14].
HA представляет собой несульфатированный неразветвленный полисахарид, состоящий из тысячи дисахаридных единиц (он содержит до 25000 дисахаридных единиц глюкуроновой кислоты и N-ацетил-глюкозамина) и достигающих массы в миллион дальтон. Гиалуронан играет важную роль в развитии и восстановлении тканей, он регулирует содержание воды и направленную миграцию молекул, образуя
гель с особыми вязкоупругими свойствами. Открытие нескольких клеточных рецепторов HA и нескольких видов взаимодействия данного полимера с другими внеклеточными молекулами (в том числе роли гиалуронановых олигонуклеотидов в механизмах воспаления и ангиогенеза), вынудило научное сообщество пересмотреть биологическую роль этого полисахарида. HA производится клетками при активации трех HAS (hyaluronic acid synthase – синтаза гиалуроновой кислоты) (HAS 1, 2 и 3), мембранных ферментов, которые производят полимер, вытесняющий цепь молекул через клеточные мембраны. Вытеснение растущей цепи HA на внеклеточный уровень через плазматическую мембрану обеспечивает безудержный рост полимера, так что он может достигать массы 1000-10000 кДа. Синтез такого огромного полимера невозможен на внутриклеточном уровне. Ответ на вопрос о том, почему в клетке имеется три различных фермента для синтеза гиалуронана, остается неизвестным. Трехчленное семейство изоферментов HAS, локализованное в трех отдельных хромосомах, было идентифицировано в человеческих и мышиных геномах [15].
Данные последовательностей указывают на наличие семи трансмембранных областей, а также на то, что центральный цитоплазматический домен содержит консенсусные последовательности, являющиеся субстратами для фосфорилирования протеинкиназой C [16]. HAS2 также задействуется в процессах развития и восстановления, включающих увеличение объема и рост тканей. HAS3 является наиболее активным ферментом семейства HAS и стимулирует синтез большого количества низкомолекулярных НА, может служить основой для гликокаликса и обеспечивать наличие НА, которая взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности. Такие более ко роткие цепи HA могут активировать каскады трансдукции сигнала и вызывать значительные изменения в жизненном цикле клеток [17].
Результаты наших исследований позволяют предположить, что ферменты связаны с различными видами метаболической регуляции, а также производят полимеры разного размера (HAS2 производит HA большого размера, а HAS3 – маленького, HAS1 активна преимущественно на эмбриональной стадии развития). HAS2 и HAS3 по-разному экспрессируются в линиях раковых клеток, и отмечалось, что HAS2 чаще связана с агрессивным раком, а HAS3 – с менее инвазивными формами опухолей [18]. Тем не менее избыточная экспрессия воздействует на доступность энергии клеткам [16].
Малая интерферирующая РНК (рибонуклеиновая кислота) HAS1-3 снижала подвижность клеток в линиях клеток опухоли яичника, изменяя цитоскелет. Высокая способность гиалуронана удерживать воду и его высокая вязко-упругость определяют уникальный характер ее профиля по сравнению с другими биологическими материалами, делая ее пригодной для применения в различных медицинских и фармацевтических целях. Множество продуктов гиалуронана присутствует в нашей повседневной жизни.
Например, поскольку он обладает способность удерживать влагу, гиалуронан используется в некоторых косметических средствах, чтобы сохранить кожу молодой и свежей. Несмотря на то, что гиалуронан в изобилии присутствует в коже, с возрастом способность гиалурона на в нашей коже удерживать воду снижается в результате деполимеризации. Широко известно о накоплении HA в тканях раны [19, 20] на первом раннем этапе после ранения, а также о том, что в течение нескольких дней местная концентрация HA в ране снижается на фоне повышения концентрации сульфированных гликозаминогликанов. Также известно, что динамика повышения концентрации HA в ране существенно отличается в ранах плода
и взрослого организма [21,22], что объясняет различия в порядке восстановления тканей у взрослых организмов и плода [23].
Некоторые авторы отмечают, что NaHA подавлял как образование свободных радикалов, так и снижение синтеза протеогликанов, индуцированного IL-1β (интерлейкин) в культивируемых хондроцитах суставов крупного рогатого скота [24]; также было продемонстрировано, что NaHA со средней молекулярной массой, составляющей 900 x 103, подавлял как снижение синтеза протеогликанов, вызванное фрагментами фибронектина, так и последующую деградацию хряща in vivo и in vitro [25].
Кроме того, HA определяет снижение деградации хряща: было продемонстрировано, что экспрессия MMP-3 (matrix metalloproteinase-3 – матричная металлопротеиназа-3) и IL-1β при обработке HAS8 подавлялась в синовиальной оболочке, но не в тканях хряща в кроличьей модели ACLT (anterior cruciate ligament transection – рассечение передней кресто образной связки), несмотря на то, что подавляющее воздействие на разрушение суставного хряща все еще сохранялось. Это говорит о том, что ингибирование разрушения суставного хряща частично связано с подавляющим действием NaHA на экспрессию MMP-3 и IL-1β в синовиальной ткани [26].
В настоящей статье мы оценили возможность стимулирования роста культивируемых фибробластов путем создания синергетического эффекта при добавлении нефрагментированной НА к PDRN.
Критическая роль микросреды в жизненном цикле клетки подтверждается большим объемом данных. Известно, что область, окружающая клетки, играет важную роль в нормальных тканях, регулируя концентрацию фактора роста, снабжая ткани питательными веществами и поддерживая интенсивное вза-
имодействие клеток. В период развития ткани эта высокоорганизованная микросреда изменяет свои функции, определенным образом модифицирует их. Микросреда представляет собой сложную структуру, образованную комплексом молекул, включая белки (коллагены, фибронектин, эластин), фрагменты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и сложные полисахариды в форме протеогликанов и гиалуронана.
Источником фрагментов ДНК считается полидезоксирибонуклеотид. PN представляет собой соединение, которое путем активации аденозиновых рецепторов оказывает различные виды воздействия на мезенхимальные клетки. Thellung e coll и Sini e coll [1, 2], впервые продемонстрировали, что PN усиливают пролиферацию фибробластов человека и вовлечение пуринергических рецепторов A2. Некоторые другие авторы изучали воздействие PN как in vitro, так и in vivo: было продемонстрировано, что PN стимулируют рост фибробластов роговицы человека [3] и остеобластов [4], улучшают репарацию фибробластов, поврежденных ультрафиолетовым излучением [5], и, по всей видимости, способствуют пролиферации преадипоцитов человека [6].
Многочисленные исследования in vivo продемонстрировали эффект PDRN (полидезоксирибонуклеотид) у пациентов, перенесших эксплантатацию кожи [7], а также его воздействие на эпителизацию роговицы после фоторефрактивной кератотомии [8].
Также было испытано влияние PN на восстановление костей [9,10], и продемонстрировано улучшение процесса заживления. Наконец, было показано, что полинуклеотид стимулирует заживле ние ран и ангиогенез, индуцируя повышение секреции VEGF (vascular endothelial growth factor – фактор роста эндотелия сосудов) при патологических состояниях с низкой тканевой перфузией, таких как сахарный диабет и тепловое повреждение [11-13].
PN представляет собой действующее вещество препарата, который используется в терапии в качестве средства, стимулирующего восстановление тканей. PN получают из молоки форели, выращенной для потребления человеком.
Фармацевтическую субстанцию получают путем экстракции с очисткой и высокотемпературной стерилизацией, позволяющей получить фармацевтическую субстанцию 95%-ной чистоты, не содержащую фармакологически активных белков и пептидов. Это соединение содержит смесь полимеров дезоксирибонуклеотидов с длиной цепи от 50 до 2000 п.о. и может также являться источником пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеозидов/дезоксирибонуклеотидов и оснований. HA присутствует в организме практически всех позвоночных и играет важную роль в развитии тканей и пролиферации клеток [14].
HA представляет собой несульфатированный неразветвленный полисахарид, состоящий из тысячи дисахаридных единиц (он содержит до 25000 дисахаридных единиц глюкуроновой кислоты и N-ацетил-глюкозамина) и достигающих массы в миллион дальтон. Гиалуронан играет важную роль в развитии и восстановлении тканей, он регулирует содержание воды и направленную миграцию молекул, образуя
гель с особыми вязкоупругими свойствами. Открытие нескольких клеточных рецепторов HA и нескольких видов взаимодействия данного полимера с другими внеклеточными молекулами (в том числе роли гиалуронановых олигонуклеотидов в механизмах воспаления и ангиогенеза), вынудило научное сообщество пересмотреть биологическую роль этого полисахарида. HA производится клетками при активации трех HAS (hyaluronic acid synthase – синтаза гиалуроновой кислоты) (HAS 1, 2 и 3), мембранных ферментов, которые производят полимер, вытесняющий цепь молекул через клеточные мембраны. Вытеснение растущей цепи HA на внеклеточный уровень через плазматическую мембрану обеспечивает безудержный рост полимера, так что он может достигать массы 1000-10000 кДа. Синтез такого огромного полимера невозможен на внутриклеточном уровне. Ответ на вопрос о том, почему в клетке имеется три различных фермента для синтеза гиалуронана, остается неизвестным. Трехчленное семейство изоферментов HAS, локализованное в трех отдельных хромосомах, было идентифицировано в человеческих и мышиных геномах [15].
Данные последовательностей указывают на наличие семи трансмембранных областей, а также на то, что центральный цитоплазматический домен содержит консенсусные последовательности, являющиеся субстратами для фосфорилирования протеинкиназой C [16]. HAS2 также задействуется в процессах развития и восстановления, включающих увеличение объема и рост тканей. HAS3 является наиболее активным ферментом семейства HAS и стимулирует синтез большого количества низкомолекулярных НА, может служить основой для гликокаликса и обеспечивать наличие НА, которая взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности. Такие более ко роткие цепи HA могут активировать каскады трансдукции сигнала и вызывать значительные изменения в жизненном цикле клеток [17].
Результаты наших исследований позволяют предположить, что ферменты связаны с различными видами метаболической регуляции, а также производят полимеры разного размера (HAS2 производит HA большого размера, а HAS3 – маленького, HAS1 активна преимущественно на эмбриональной стадии развития). HAS2 и HAS3 по-разному экспрессируются в линиях раковых клеток, и отмечалось, что HAS2 чаще связана с агрессивным раком, а HAS3 – с менее инвазивными формами опухолей [18]. Тем не менее избыточная экспрессия воздействует на доступность энергии клеткам [16].
Малая интерферирующая РНК (рибонуклеиновая кислота) HAS1-3 снижала подвижность клеток в линиях клеток опухоли яичника, изменяя цитоскелет. Высокая способность гиалуронана удерживать воду и его высокая вязко-упругость определяют уникальный характер ее профиля по сравнению с другими биологическими материалами, делая ее пригодной для применения в различных медицинских и фармацевтических целях. Множество продуктов гиалуронана присутствует в нашей повседневной жизни.
Например, поскольку он обладает способность удерживать влагу, гиалуронан используется в некоторых косметических средствах, чтобы сохранить кожу молодой и свежей. Несмотря на то, что гиалуронан в изобилии присутствует в коже, с возрастом способность гиалурона на в нашей коже удерживать воду снижается в результате деполимеризации. Широко известно о накоплении HA в тканях раны [19, 20] на первом раннем этапе после ранения, а также о том, что в течение нескольких дней местная концентрация HA в ране снижается на фоне повышения концентрации сульфированных гликозаминогликанов. Также известно, что динамика повышения концентрации HA в ране существенно отличается в ранах плода
и взрослого организма [21,22], что объясняет различия в порядке восстановления тканей у взрослых организмов и плода [23].
Некоторые авторы отмечают, что NaHA подавлял как образование свободных радикалов, так и снижение синтеза протеогликанов, индуцированного IL-1β (интерлейкин) в культивируемых хондроцитах суставов крупного рогатого скота [24]; также было продемонстрировано, что NaHA со средней молекулярной массой, составляющей 900 x 103, подавлял как снижение синтеза протеогликанов, вызванное фрагментами фибронектина, так и последующую деградацию хряща in vivo и in vitro [25].
Кроме того, HA определяет снижение деградации хряща: было продемонстрировано, что экспрессия MMP-3 (matrix metalloproteinase-3 – матричная металлопротеиназа-3) и IL-1β при обработке HAS8 подавлялась в синовиальной оболочке, но не в тканях хряща в кроличьей модели ACLT (anterior cruciate ligament transection – рассечение передней кресто образной связки), несмотря на то, что подавляющее воздействие на разрушение суставного хряща все еще сохранялось. Это говорит о том, что ингибирование разрушения суставного хряща частично связано с подавляющим действием NaHA на экспрессию MMP-3 и IL-1β в синовиальной ткани [26].
В настоящей статье мы оценили возможность стимулирования роста культивируемых фибробластов путем создания синергетического эффекта при добавлении нефрагментированной НА к PDRN.
